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检测磷酸化蛋白的直接检测有何作用?

2018-07-26 浏览次数:107

       蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分,它们影响了众多负责生物反应的下游效应物,因此,评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的,在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化,包括显色、放射性或荧光检测。此外,R&D Systems还提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit,能够定量任何可产生ADP的激酶的活性。尽管我们能够获得有关特定激酶行为的信息,但评估细胞提取物中的酶活性仅仅揭开了信号通路的冰山一角。我们对蛋白如何被修饰还知之甚少,且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。磷酸化蛋白的直接检测可能为细胞如何应对外界刺激提供更详细的分析,因为磷酸化肽段的鉴定为蛋白的表达和功能状态提供信息。
  直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育,获得细胞提取物,通过SDS-PAGE分离,并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育,且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳,这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。
  鉴于这些方法很费力,磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。1981年,第一个有记录的磷酸化抗体在兔子中产生,使用的是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸结合物。这一抗体广泛地识别了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后,利用合成的磷酸化肽段来免疫兔子,开发出多个磷酸化状态特异抗体,这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中,产生高度特异的免疫试剂。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在任何技术中使用磷酸化特异抗体的忠告是,成功的检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。
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